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免疫荧光实验步骤

发布时间:2019-09-18 11:46 |  点击次数:

 

一.脱蜡至水
  1. C8H10 Ⅰ(8min)
  2. C8H10 Ⅱ(8min)
  3. 无水乙醇和C8H10   1:1(5min)
  4. 无水乙醇(3min)
  5. 95%乙醇(3min)
  6. 85%乙醇(3min)
  7. 75%乙醇(3min)
  8. PBS洗3遍
二.抗原修复
柠檬酸钠抗原修复液修复。
抗原修复100℃  20min  ;自然冷却至室温。
三.PBST洗2遍,PBS洗1遍。每次5min。
四.用30%H2O2和甲醇配制3%的H2O2溶液。每张切片加1滴,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3遍。
五.封闭  3-5%BSA或者1-2%FBS封闭30min
六.除去封闭液液,每张切片加1滴或50μl的第一抗体, 4℃过夜。
抗体稀释液:1%FBS溶液(可以加0.01%叠氮钠)
抗体稀释比例: DRD1  Rb  pAb  1:500 ;NK-1R  goat  pAb  1:200;
七.洗一抗。PBS洗3遍,每次5min。
八.孵二抗2h(室温) FITC标记山羊抗兔二抗;Cy3标记驴抗山羊二抗
九.洗二抗   PBS洗3遍,每次5min
十.擦干标本边缘水分,加DAPI(1ug/ml)5min;
十一.PBS洗3遍,每遍3min,加mouting(sigma M1289),盖盖玻片,指甲油封片。